Parte I


A descoberta

Partindo do princípio de que o fenômeno que estavam observando dependia de uma proteína (protease) que efetuava a hidrólise do substratoalvo na presença de ATP, e que essa protease era parte integrante do conteúdo protéico do lisado de reticulócitos, esses pesquisadores aplicaram o lisado a uma coluna cromatográfica de Sepharose® DEAE com o objetivo de separar (isolar) essa protease desconhecida. Duas das frações obtidas nesse processo, quando eram misturadas, reconstituíam a proteólise ATPdependente. No entanto, quando testadas separadamente não apresentavam atividade. Continuando a purificação das proteínas contidas em cada uma dessas frações, eles isolaram uma proteína termoestável de massa molecular 9000 u. Essa proteína foi identificada como um componente ativo para que ocorresse proteólise ATP-dependente. Quando essa proteína era adicionada à outra fração ocorria proteólise, porém nunca na sua ausência. Denominaram essa proteína de APF-1 (Active Principle of Fraction 1). Ela foi identificada em 1980 como sendo a ubiquitina que já havia sido descrita anteriormente, porém desconhecia-se sua atividade. Rapidamente, verificou-se que a molécula dessa proteína tinha 76 resíduos de aminoácidos e era altamente conservada nas células eucarióticas, sendo essencialmente idêntica em organismos tão distintos como uma levedura ou uma vaca.

Continuando o fracionamento por técnica cromatográfica, conseguiram identificar uma fração que continha as enzimas tiólicas E1 e E2 e a enzima E3 e, numa outra fração, identificaram uma proteína de alta massa molecular, também essencial para a atividade que haviam descrito. Muito provavelmente essa proteína era a protease que buscavam. No entanto, foi somente 10 anos mais tarde que ela foi identificada por outros investigadores como sendo o proteassoma, na verdade um complexo protéico de alta massa molecular capaz de reconhecer e catalisar a hidrólise de proteínas marcadas com cauda de ubiquitina. Os experimentos escritos acima e as conclusões a que chegaram estão descritos em publicações de 1978 e 1979 (Ciechanover et al., 1978; Hershko et al., 1979).

Ciechanover, Hershko e Rose continuaram buscando os elementos do processo de proteólise ATP-dependente, desviando-se daí em diante da protease e concentrando-se nos demais componentes do processo. Uma vez tendo purificado a ubiquitina (Ub), chamada de APF-1 até aquele momento, eles a marcaram com iodo radioativo (125I) e demonstraram inequivocamenteque inúmeras proteínas no lisado de reticulócitos estavam ligadas covalentemente à Ub. Logo em seguida, numa outra série de experimentos, fizeram marcação de três proteínas diferentes com 125I ao invés de marcar a Ub. Utilizando essas proteínas como substratos da proteólise, eles demonstraram que múltiplas unidades de Ub podiam conjugar-se com a proteína-alvo.

Essa seqüência de trabalhos (Ciechanover et al., 1980; Hershko et al.,1980) incluiu ainda uma série de detalhes sobre como é a ligação de Ub às proteínas-alvo e, também, antecipou a existência de uma enzima que remove da proteína-alvo a cauda de poliubiquitina. Entre 1981 e 1983, tendo já sido criada a hipótese sobre o sistema de marcação com Ub da proteólise ATPdependente, eles se dedicaram à elucidação completa do processo. Os trabalhos dessa época culminaram com a purificação e caracterização das três enzimas ubiquitinadoras (E1-E3) e elucidaram o mecanismo completo de marcação por Ub.

Os trabalhos desse período são ainda textos-referência para a descrição do sistema. Eles utilizaram protocolos experimentais bastante elegantes àquela época. Purificaram a enzima E1 por cromatografia de afinidade ligando a Ub covalentemente a uma coluna de Sepharose®. O lisado de reticulócitos era aplicado à coluna, sendo que a enzima E1 ficava retida na coluna por ligação à Ub; dessa maneira conseguiram purificar e demonstrar o tipo de ligação covalente entre Ub e E1. Utilizando-se de metodologia semelhante conseguiram purificar as duas outras enzimas: E2 e E3. Neste caso, usaram como estratégia eluições diferenciadas – lembrando que a eluição consiste na etapa cromatográfica que usa um solvente ou solução para retirar o material retido na coluna. Dessa maneira isolaram as três enzimas e demonstraram que E2 liga-se a E1 na coluna diferentemente de E3, que era eluída da coluna isoladamente. Todos esses passos estão descritos em publicações feitas por eles em 1981 e 1983 (Ciechanover et al., 1981; Hershko et al., 1983).

O processo de degradação de proteínas sinalizado por ubiquitina participa de inúmeros processos intracelulares muito importantes para a manutenção da homeostase ou da defesa celular. Alguns exemplos são enumerados a seguir.

Alguns dos peptídeos gerados dentro da célula pelo sistema Ub-proteassoma são utilizados pela célula como antígenos de superfície celular e são reconhecidos pelos linfócitos T. Se esses peptídeos não forem produtos de uma proteína humana, os linfócitos T reconhecem o peptídeo na superfície celular como um antígeno, um componente estranho, e desencadeiam o processo que levará à destruição daquela célula. Esse mecanismo é muito importante em casos de infecção viral. Uma célula infectada com um vírus terá como produtos de hidrólise peptídeos originários de proteínas virais que serão reconhecidos pelos linfócitos T como estranhos ao organismo e, portanto, a célula será destruída, evitando a continuidade da replicação viral.

As células possuem proteínas denominadas fatores de transcrição. Essas proteínas se ligam ao DNA e induzem a transcrição de determinados genes. Um desses fatores de transcrição, denominado NFkB, localiza-se no citoplasma associado a uma proteína que inibe sua atividade

junto ao DNA. Quando a célula é infectada por uma bactéria, esse inibidor sofre uma alteração estrutural, é ubiquitinado e degradado pelo proteassoma. Dessa maneira a proteína NFkB fica livre e desloca-se para o núcleo, desencadeando a transcrição de inúmeros genes relacionados à resposta inflamatória que se constitui em um processo vital de defesa.

Inibidores do proteassoma ou da ubiquitinação protéica estão prestes a serem introduzidos na terapêutica anti-tumoral. Essa estratégia se baseia no fato de que a inibição irreversível do sistema Ub-proteassoma leva a célula à morte celular programada – apoptose -, muito desejável em se tratando de células tumorais, pois impede que elas proliferem.

CIECHANOVER, A.; HELLER, H.; ELIAS, S.; HAAS, A.L. e HERSHKO, A. ATP-dependent conjugation of reticulocyte proteins with the polypeptide required for protein degradation. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 77, p. 1365-1368, 1980.

CIECHANOVER, A.; HELLER, H.; KATZ-ETZION, R. e HERSHKO, A. Activation of the heat-stable polypeptide of the ATP-dependent proteolytic system. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 78, p. 761-765, 1981.

CIECHANOVER, A.; HOD, Y. e HERSHKO, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 81, p. 1100-1105, 1978.

HERSHKO, A.; CIECHANOVER, A.; HELLER, H.; HAAS, A.L. e ROSE, I.A. Proposed role of ATP in protein breakdown: Conjugation of proteins with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci., v.77, p. 1783-1786, 1980.

HERSHKO, A.; CIECHANOVER, A. e ROSE, I.A. Resolution of the ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes: A component that interacts with ATP. Proc. Natl. Acad. Sci., v. 76, p. 3107-3110, 1979.

HERSHKO, A.; HELLER, H.; ELIAS, S. e CIECHANOVER, A. Components of ubiquitin-protein ligase system. J. Biol. Chem., v. 258, p. 8206-8214, 1983.

Já postei aqui um texto meu sobre o sistema ubiquitina-proteassoma a um tempo atrás. Agora vou postar a primeira parte do artigo publicado pela professora Dra Marilene Demasi, do Instituto Butantan, publicado na revista Química Nova na Escola logo após os pesquisadores que desvendaram o funcionamento deste sistema receberam o prêmio Nobel de Química em 2004. Espero que gostem.

Prêmio Nobel de Química 2004: Proteólise ATP-Dependente de Proteínas Marcadas com Ubiquitina

A primeira referência à degradação intracelular de proteínas foi feita por Schoenheimer em 1942, que, através de marcação radioisotópica, demonstrou que proteínas são constantemente sintetizadas e desmontadas. A partir de então, várias proteases envolvidas na degradação protéica não-dependente de energia foram descritas. Uma das primeiras a ser amplamente estudada foi a tripsina, na luz intestinal, responsável pela catálise da hidrólise de proteínas ingeridas na dieta alimentar (proteólise extracelular).

O processo intracelular de degradação protéica dependente de energia, captada na forma de ATP, foi descrito pela primeira vez por Sympson em 1953 e retomado por Hershko em 1971. Este pesquisador, durante um estágio de pós-doutoramento no laboratório de Gordon Tomkins, na Universidade da Califórnia, em São Francisco, publicou um trabalho realizado com cultura de células hepáticas, mostrando que a degradação intracelular da enzima tirosina aminotransferase era um processo dependente de ATP . Na época, o fato de que a degradação de proteínas pudesse consumir energia era paradoxal, uma vez que a proteólise é uma reação de hidrólise e, portanto, um processo exotérmico. Hershko, no entanto, insistiu nessa investigação exatamente pela aparente contradição. Suas conclusões nesse trabalho, que foi considerado um marco para investigações posteriores, convergiam para a possibilidade da existência de um processo proteolítico mais complexo do que aqueles conhecidos até então. Concluiu afirmando que: “Esta dependência por ATP para a degradação protéica intracelular parece ser incompatível com um mecanismo proteolítico simples e sugere que o processo seja de múltiplas etapas… Pode ser que o ATP esteja diretamente envolvido na modificação da proteína antes de sua degradação ou na formação de um metabólito intermediário”.

Um importante avanço nos estudos da proteólise ATP-dependente foi o modelo experimental publicado por Etlinger e Goldberg, em 1977, utilizando lisado de reticulócitos de coelho. Lisado é o material citoplasmático obtido experimentalmente pelo rompimento mecânico de células e posterior centrifugação para se obter a fração solúvel do citoplasma celular. Esse sistema levantou a possibilidade de se poder distinguir a atividade proteolítica lisossomal da não-lisossomal. O lisossoma é o compartimento intracelular responsável pela degradação de inúmeras macromoléculas, incluindo proteínas extracelulares, que são trazidas para o interior das células pelo processo de endocitose, além de proteínas de membranas e proteínas intracelulares de vida média longa. Um exemplo de proteína com vida longa é a hemoglobina: aproximadamente 110 dias. No modelo de estudo proteolítico com lisado de eritrócitos foi possível a diferenciação entre atividade proteolítica não-lisossomal e lisossomal, uma vez que as enzimas lisossomais têm atividade proteolítica em pH ácido, sendo que a atividade ATP-dependente, então descrita, possuía atividade ótima em pH ligeiramente alcalino, nominalmente 7,8.

Foi a partir de então, entre o final da década de 70 e início da de 80, que Ciechanover, Hershko e Rose desenvolveram uma série de estudos que culminaram com a elucidação do mecanismo de proteólise dependente de ATP e da ubiquitina. Os encontros que mantiveram e o trabalho realizado em conjunto foram possíveis graças a uma série de estágios sabáticos de Ciechanover e Hershko no laboratório de Rose, na Pensilvânia (EUA).

Aaron Ciechanover

Avram Hershko

Irwin Rose

Texto de: Demasi e Bechara. Química Nova na Escola, n.20, p. 3-8, 2004.